一、液相色譜儀的結(jié)構(gòu)：
hplc的出現(xiàn)不過三十多年的時(shí)間，但這種分離分析技術(shù)的發(fā)展十分迅猛，目前應(yīng)用也十分廣泛。其儀器結(jié)構(gòu)和流程也多種多樣。液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置(用雙泵)、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、恒溫器、記錄儀等主要部件。
1 、高壓泵
HPLC使用的色譜柱是很細(xì)的(1——6mm)，所用固定相的粒度也非常小(幾μm到幾十μm)，所以流動(dòng)相在柱中流動(dòng)受到的阻力很大，在常壓下，流動(dòng)相流速十分緩慢，柱效低且費(fèi)時(shí)。為了達(dá)到快速、分離，必須給流動(dòng)相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動(dòng)速度。為此，須用高壓泵進(jìn)行高壓輸液。高壓、高速是液相色譜的特點(diǎn)之一。
HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：
a 流量恒定，無脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍(一般為1——10ml/min);
b 能抗溶劑腐蝕;
c 有較高的輸液壓力;對(duì)一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了，對(duì)分離，要求達(dá)到150——300×105Pa。
(1)往復(fù)式柱塞泵
當(dāng)柱塞推入缸體時(shí)，泵頭出口(上部)的單向閥打開，同時(shí)，流動(dòng)相進(jìn)入的單向閥(下部)關(guān)閉，這時(shí)就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時(shí)，流動(dòng)相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時(shí)關(guān)閉，一定量的流動(dòng)相就由其儲(chǔ)液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個(gè)色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動(dòng)相。
(2)氣動(dòng)放大泵
其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動(dòng)大面積(SA )活塞A，則在小面積(SB )活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于A和B兩活塞的面積比，如果A與B的面積之比為50：1 ，則壓力為5×105Pa的氣體就可得到壓力為250×105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。
2 、梯度洗提
類似于GC中的程序升溫。已成為現(xiàn)代液相色譜中*的部分。
梯度洗提，就是載液中含有兩種(或更多)不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。梯度洗提可以分為兩種：
a 低壓梯度(也叫外梯度)：在常壓下，預(yù)先按一定程序?qū)煞N或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺(tái)高壓泵輸入色譜柱。
b 高壓梯度 (或稱內(nèi)梯度系統(tǒng) )：利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設(shè)定的比例送入梯度混合室，混合后，進(jìn)入色譜柱。
3 、進(jìn)樣裝置
(1)注射器進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣所用微量注射器及進(jìn)樣方式與GC法一樣。進(jìn)樣壓力<150×105Pa，當(dāng)進(jìn)樣壓力>150×105Pa時(shí)，必須采用停流進(jìn)樣。
(2)高壓定量進(jìn)樣閥：與GC法用的流通法相似，能在高壓下進(jìn)樣。
4、色譜柱
色譜柱是色譜儀重要的部件(心臟)。通常用后壁玻璃管或內(nèi)壁拋光的不銹鋼管制作的，對(duì)于一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時(shí)，可用銅管、鋁管或聚四氟乙烯管。
柱子內(nèi)徑一般為1——6mm。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為4.6或3.9mm ，長(zhǎng)度為15——30cm的直形不銹鋼柱。填料顆粒度5——10μm ，柱效以理論塔板數(shù)計(jì)大約7000——10000 。
發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。
5、檢測(cè)器
(1)紫外光度檢測(cè)器
它的作用原理是基于被分析試樣組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比爾定律。是常用的檢測(cè)器，應(yīng)用廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。其特點(diǎn)是：
a 靈敏度高：其小檢測(cè)量10-9g·ml-1，故即使對(duì)紫外光吸收很弱的物質(zhì)，也可以檢測(cè);
b 線性范圍寬;(比爾定律)
c 流通池可做的很小(1mm×10mm，容積8μl);
d 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫;
e 波長(zhǎng)可選，易于操作：如，使用裝有流通池的可見紫外分光光度計(jì)(可變波長(zhǎng)檢測(cè)器)。
缺點(diǎn)：對(duì)紫外光*不吸收的試樣不能檢測(cè);同時(shí)溶劑的選擇受到限制。
(2)光電二極管陣列檢測(cè)器
紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展;陣列由1024個(gè)光電二極管陣列，每個(gè)光電二極管寬僅50μm，各檢測(cè)一窄段波長(zhǎng)。如圖所示，在檢測(cè)器中，光源發(fā)出的紫外或可見光通過液相色譜流通池，在此流動(dòng)相中的各個(gè)組分進(jìn)行特征吸收，然后通過狹縫，進(jìn)入單色其進(jìn)行分光，后由光電二極管陣列檢測(cè)，得到各個(gè)組分的吸收信號(hào)。經(jīng)計(jì)算機(jī)快速處理，得三維立體譜圖。
(3)熒光檢測(cè)器
熒光檢測(cè)器是一種高靈敏度、高選擇性檢測(cè)器。對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。熒光檢測(cè)器的結(jié)構(gòu)及工作原理和熒光光度計(jì)相似。
(4)差示折光檢測(cè)器
除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用多的檢測(cè)器。差示折光檢測(cè)器是借連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率的方法來測(cè)定試樣濃度的檢測(cè)器。溶液的折射率是純?nèi)軇?流動(dòng)相)和純?nèi)苜|(zhì)(試樣)折射率乘以各物質(zhì)的濃度之和。因此溶有試樣的流動(dòng)相和純流動(dòng)相之間折射率之差表示試樣在流動(dòng)相中的濃度。
(5)電導(dǎo)檢測(cè)器
其作用原理是根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生電導(dǎo)變化來測(cè)定電離物質(zhì)含量。
二、液相色譜儀的應(yīng)用實(shí)例
氣相色譜法與液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大(大于400以上)的有機(jī)物(這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%——80%)原則上都可應(yīng)用液相色譜法來進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70——80%。